微化研プロジェクト

プリオナーゼ

  • 笠原 優一(かさはらゆういち) 技術職員
  • 大沢 育子(おおさわいくこ)  技術補佐員
  • 馬渡 貴子(まわたりたかこ)  技術補佐員

研究の背景

近年、社会的に大変な問題となっている狂牛病(ウシ海綿状脳症;BSE)などのプリオン病は、細胞内の正常型プリオンタンパク質が感染型のプリオンタンパク質に高次構造変換することが原因で起こる疾患の総称であり、動物ではヒツジのスクレイピー、ヒトではクールー病、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症などが知られている。

正常型のプリオンタンパク質は通常の脳組織にも発現しており、これが何らかの作用でβシート構造に富んだアイソフォームに変化し、脳内に凝集することで神経疾患を引き起こすと推定されている(図1)。異常プリオンタンパク質は、正常型のプリオンタンパク質と異なり①熱や、酸、アルカリ、界面活性剤やプロテアーゼに対して強い抵抗性を持つ②感染性を有するという特徴がある。

<図1 正常プリオンタンパク質(左)から異常プリオンタンパク質(右)への立体構造の変換>
正常プリオンタンパク質(左)から異常プリオンタンパク質(右)への立体構造の変換

そこで本プロジェクトでは、鹿児島大学農学部獣医学科教授 故岡達三博士との共同研究で異常プリオンタンパク質を分解でき、不活性化、消毒できるタンパク質分解酵素プリオナーゼ(日本国商標第4932402号、第4925193号、米国商標第76642159号)を2004年に発見した。屠畜場で使用された器具の清浄化および消毒、家畜の餌として使用された肉骨粉に含まれる異常プリオンタンパク質の分解および感染した場合に異常プリオンタンパク質が存在する可能性の高い、ソーセージを製造する際に用いられる天然ケーシング(羊腸)の無害化などに取り組んでいる。

研究の成果

プリオナーゼ産生微生物の分離 我々は1999年に許可を得て千葉県習志野市の谷津干潟から新種と推定されるStreptomyces属の放線菌を分離した。谷津干潟は東京湾奥部に発達した前浜干潟が残った場所で、有機質に富む泥質の干潟である。また、2本の水路で海と接続しており、有機物の分解の場、多様な生物相が存する場所である。

<図2 谷津干潟の場所(千葉県習志野市)>
谷津干潟の場所(千葉県習志野市)
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干潟の場所は以前には海だったが、現在の干潟がある場所の周囲は埋め立てられた。

<図3 プリオナーゼ産生微生物99-GP-2D-5株の発見場所>
プリオナーゼ産生微生物99-GP-2D-5株の発見場所

干潟の出入り口の水路から分離した。潮の満ち引きに伴い、海水と陸水が激しく出入りを繰り返す場所である。また、住宅地が周囲に広がるため生活排水などの流入も多い。

<図4 谷津干潟全景>
図4 谷津干潟全景

内陸に残された干潟。ラムサール条約指定地。

強力なタンパク質分解活性を有する微生物は、プリオナーゼ以外にも特に干潟から数多く分離された。

プリオナーゼ産生微生物99-GP-2D-5株 99-GP-2D-5株は放線菌のひとつであり、形態や生理生化学的性状、16SrDNA配列にもとづく系統樹の解析から、Streptomyces属の微生物であること判った(図5、6)。

<図5 プリオナーゼ産生微生物99-GP-2D-5株>
(左;斜面培地上の形態、右;電子顕微鏡写真、両者とも微生物化学研究所 木下直子氏撮影)
プリオナーゼ産生微生物99-GP-2D-5株(左;斜面培地上の形態、右;電子顕微鏡写真、両者とも微生物化学研究所 木下直子氏撮影)
<図6 16SrDNA配列に基づく99-GP-2D-5株の分類学的位置>
16SrDNA配列に基づく99-GP-2D-5株の分類学的位置
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プリオナーゼの探索 異常プリオンタンパク質は、感染の危険があり異常プリオンタンパク質を用いた研究がP3以上の安全レベルを有する研究室に限られているなど、取り扱いが困難であり研究を進める上で限界がある。加えて本研究の着手期には国内での狂牛病の発生例が少なく異常プリオンタンパク質の入手が困難であった。そのために本研究では、異常プリオンタンパク質と立体構造が類似しており耐熱性、耐酸、耐アルカリ性および耐タンパク質分解酵素性を有する過塩素酸可溶性タンパク質(PSP)を異常プリオンタンパク質の代用基質として用いた。PSPは、肝臓からタンパク質合成阻害活性を有するタンパク質として岡らによって1995年に発見され、mRNAに特異的に作用するヌクレアーゼであるが、免疫疾患抑制、抗がん作用などの多くの作用が報告されている。PSPは内側に6か所のβシート構造、外側に2か所のαへリックス構造を持つ。(図7)

<図7 異常プリオンタンパク質(左)と過塩素酸可溶性タンパク質(右)の立体構造の比較>異常プリオンタンパク質(左)と過塩素酸可溶性タンパク質(右)の立体構造の比較

1000種類以上の微生物培養液から、PSP分解を指標にした探索により、プリオナーゼを発見した(図8)。

<図8 PSPを分解する酵素の探索(ウェスタンブロット法)>異常プリオンタンパク質(左)と過塩素酸可溶性タンパク質(右)の立体構造の比較

プリオナーゼの構造と性質 プリオナーゼは新規なタンパク質分解酵素であり、分子量は約19kDa、至適温度、pHはそれぞれ70℃、8だった。

<図9 プリオナーゼ(E77)の電気泳動像>
異常プリオンタンパク質(左)と過塩素酸可溶性タンパク質(右)の立体構造の比較

アルカリ性セリンプロテアーゼの一種で、相対分子質量は19,327だった。

<図10 プリオナーゼによるスクレイピータンパク質の分解>
図10 プリオナーゼによるスクレイピータンパク質の分解

1.コントロール
2.Proteinase Kによる処理
3.10μLのプリオナーゼ含有培養液による処理(30min 37℃)
4.20μLのプリオナーゼ含有培養液による処理(30min 37℃)

<図11 プリオナーゼによるスクレイピープリオンタンパク質の分解(経時変化)>
図11 プリオナーゼによるスクレイピープリオンタンパク質の分解(経時変化)

A;スクレイピープリオンタンパク質のウェスタンブロット像
B;プリオナーゼ処理による、スクレイピープリオンタンパク質の残存(0分比)

期待される成果

  1. 医療現場および屠畜場で使用された器具の清浄化および消毒。

    異常プリオンタンパク質は、高圧滅菌処理(オートクレーブ)など、一般の医療機関で行われている消毒処理は効果がなく、焼却処理しか方法がないのが現状である。プリオナーゼを消毒薬として利用することにより、完全に異常プリオンタンパク質を分解することができる。

  2. 異常プリオンで汚染された排水の処理

    土壌、地下水または地表水中での異常プリオンタンパク質が環境中に放出され、それによりさらなる感染の循環が再生産される可能性がある。異常プリオンタンパク質がヒトや動物の再感染、肥料、作物などに移動する恐れを排除するために、プリオナーゼで病因タンパク質を完全に破壊し、感染性を消失させることができる。異常プリオンタンパク質は134℃、18分の通常の条件より高温、高圧下のオートクレーブ処理によって失活するが、プリオナーゼ処理では37℃、10分の穏やかな条件下で完全に分解することができる。

  3. 異常プリオンタンパク質を分解することによる肉骨粉の再資源化

    肉骨粉(牛・豚・鶏から食肉を除いたあとの屑肉、脳、脊髄、骨、内臓、血液を加熱処理の上、油脂を除いて乾燥、細かく砕いて粉末としたもの。豚・鶏の飼料、農作物の肥料、ペットフードの原料となる)は畜産業において廃棄物として大量に生ずる。家畜の餌に混合して利用される他、セメントの材料として再利用されている。安全に肉骨粉を利用するため、プリオナーゼによる清浄化が期待される。

  4. 羊腸ケーシングの洗浄など食品産業分野での応用

    羊腸は天然ケーシングとしてソーセージの皮(ケーシング)に利用されている。ところで、フランスでは羊にBSEを実験的に感染させると、BSEが感染することが報告されている。しかし現在までのところ自然界ではBSEに感染した羊は確認されていない。将来にBSEに感染された羊腸が発生する可能性がある。羊腸のケーシング業界には、BSEに感染された羊腸からBSEあるいはスクレーピープリオンタンパク質を浄化する方法を事前に開発する要求がある。鹿児島大学および株式会社松永商会との共同研究で、異常プリオンタンパク質を有し得る天然ケーシングにプリオナーゼを加え、所定の温度でインキュベートし、インキュベート終了後に阻害剤を添加して反応を停止させ、水洗により分解酵素を失活した場合に、天然ケーシングの異常プリオンを除去し浄化できることを見出した。

  5. プリオナーゼは強力なタンパク質分解酵素であることから、他の難分解性動物タンパク質の分解にも応用可能である。当プロジェクトでは、クラゲの酵素処理についても研究を行っている。現在は、プリオナーゼ以外の酵素を用いた系も確立しており、短時間・低コストな処理システムを開発中である。

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    図 定置網に混入したエチゼンクラゲ(秋田県男鹿市 第18瑤光丸 平川秀三郎 氏のご好意による)

    <図 定置網に混入したエチゼンクラゲ(秋田県男鹿市 第18瑤光丸 平川秀三郎 氏のご好意による)>

関連論文

  • Zhao Hui, Hiroyasu Doi, Hiroaki Kanouchi, Yuichi Matsuura, Shiro Mohri, Yoshiaki Nonomura and Tatsuzo Oka Alkaline Serine Protease produced by Streptomyces sp. degrades PrPsc, Biochem. Biophys. Res. Commun., 321, 45-50 (2004)
  • Zhao Hui, Kazuhisa Minamiguchi, Hiroyasu Doi, Naoko Kinoshita, Hiroaki Kanouchi and Tatsuzo Oka Recombinant Alkaline Serine Protease II Degrades Scrapie Isoform of Prion Protein, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, 40(8-9), 293-296 (2004)
  • Hiroyasu Doi, Mikio Takeda, Tatsuzo Oka and Yoshiaki Nonomura  The Dissolution of Jellyfish by Enzyme and the Treatment of Its Wastewater, Bull. Soc. Sea Water Sci., Jpn, 60( 4), 311-312 (2006)
  • 土井 宏育、武田 美貴雄、岡 達三、野々村 禎昭 微生物酵素によるミズクラゲの分解処理, 日本海水学会誌, 60(6), 426-433 (2006)
  • 土井 宏育、岡 達三、野々村 禎昭 放線菌が産生するプロテアーゼによるエチゼンクラゲ分解への適用 日本水産学会誌, 74(5), 784-795 (2008)
  • 今井俊明、武田美貴雄、土井宏育 酵素を用いたクラゲ処理の研究 火力原子力発電, 60(7), 2-6 (2009)

関連特許

  • ストレプトミセス属微生物、難分解性蛋白質分解プロテアーゼ、難分解性蛋白質分解用組成物、及び難分解性蛋白質の分解方法
    特許公開2005-34152
    発明者:土井宏育、木下直子、岡達三、趙卉
  • 湿式処理装置、並びに、難溶性蛋白質の分解方法、クラゲ分解組成物及びそれを用いたクラゲの分解方法
    特許公開2005-262105
    発明者:土井宏育、岡達三
  • プリオン分解酵素による天然ケーシングの浄化法
    特許公開2006-180826
    発明者:岡達三、土井宏育、荒川博夫